目錄細(xì)胞生物學(xué)研究方法與技術(shù) 諾貝爾細(xì)胞生物學(xué)獎(jiǎng) 細(xì)胞生物學(xué)涉及到的方法 細(xì)胞研究方法思維導(dǎo)圖 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的思維導(dǎo)圖
細(xì)胞生物學(xué)，研究各種細(xì)胞的功能類(lèi)別及細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)與細(xì)胞運(yùn)作及新陳代謝方式。還有面向醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞生物學(xué)及干細(xì)胞醫(yī)學(xué)，以及細(xì)胞工程，免疫醫(yī)學(xué)等。
a.觀察細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡技術(shù)； b.探索細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡技術(shù)； c.研究蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)的X射線(xiàn)衍射技術(shù)； d.用于分離細(xì)胞內(nèi)不同大小細(xì)胞器的離心技術(shù)； e.用于培養(yǎng)具有新性狀細(xì)胞的細(xì)胞融合和雜交技術(shù)； f.使機(jī)體細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)； g.能對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)并測(cè)其體積、DNA含量等數(shù)據(jù)的流式細(xì)胞術(shù)； h.利用放射性同位素對(duì)細(xì)胞中的DNA、RNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行定位的放射自顯影技術(shù)； i.用于探測(cè)基因組中英雄模范種基因是否存在，是否表達(dá)以及拷貝數(shù)多少的核酸分子雜交技術(shù)； j.能將細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或梳酸分子進(jìn)行分離純化的層析技術(shù)和電泳技術(shù)； k.對(duì)細(xì)胞化學(xué)定性、定量分析的顯微分光光度術(shù)，顯微熒光光度術(shù)，核磁共振技術(shù)。
【答案】：細(xì)胞組分的分析方法及其應(yīng)用：①超速離心技術(shù)可用于細(xì)胞組分的分離與純化；②成分分析與細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)合產(chǎn)生了細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、原位雜交技術(shù)等；③核素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合放射自顯影可以研究多種生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。
發(fā)展歷史
細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞學(xué)說(shuō)和細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)。1839年，Schwann和Schleiden建立了細(xì)胞學(xué)說(shuō)，細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)入快速發(fā)展階段。德國(guó)學(xué)者Haberlandt（1902年）在發(fā)表的《植物細(xì)胞立體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》的論文中提出了細(xì)胞全能性的觀點(diǎn)。H?nning（1904年）進(jìn)行了幼胚的立體培養(yǎng)，在含有糖、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和植物提取物的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)蘿卜和辣根菜的幼胚，發(fā)現(xiàn)離體幼胚均可充分發(fā)育，并且可以提前萌發(fā)成苗。
1925年，Laibach培養(yǎng)亞麻種間雜交幼胚獲得成功，并得到雜交種。從20世紀(jì)20年代起，幼胚培養(yǎng)被用來(lái)挽救遠(yuǎn)緣雜交早期敗育的胚胎，因此可以認(rèn)為，幼胚培養(yǎng)和胚胎拯救（embyrorescue）技術(shù)是最早應(yīng)用的植物細(xì)胞工程技術(shù)。
20世紀(jì)30年代，植物組織培養(yǎng)技術(shù)基本建立。李繼侗（1933年）將3mm以上的銀杏胚培養(yǎng)成功，并且發(fā)現(xiàn)加入胚乳汁可以促進(jìn)離體胚的成長(zhǎng)。1937年，White發(fā)現(xiàn)B族維生素、吲哚乙酸對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。1937~1939年，White、Gautheret和Nobercourt分別建立了植物組織的連續(xù)培養(yǎng)物，使離體的植物組織可以在人工培養(yǎng)基上不斷生長(zhǎng)，從而奠定了現(xiàn)代組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)。
20世紀(jì)60年代初，Cocking等人用纖維素酶來(lái)分離植物原生質(zhì)體并獲得成功。分離得到的原生質(zhì)體在培養(yǎng)過(guò)程中，可長(zhǎng)出新壁，進(jìn)行分裂和分化，最終形成完整植株。獲得成功的植物有胡蘿卜、矮牽牛、油菜、石刁柏等。
在動(dòng)物學(xué)界，1907年美國(guó)生物學(xué)家哈里森用蓋玻片懸滴培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織，存活數(shù)周，而且觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)現(xiàn)象，開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的先河。
德國(guó)胚胎學(xué)家Spemamm（1938年）認(rèn)為，早期胚胎細(xì)胞具有高度的分化潛能，將胚胎的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，可以發(fā)育為新的胚胎。Briggs和Kings（1952年）把非洲豹蛙囊胚的細(xì)胞核一到去核的卵母細(xì)胞中，得到了非洲豹蛙的胚胎克隆后代，從而證實(shí)了Spemamm的觀點(diǎn)。
Okata（1962年）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒（Sendal virus）可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合，形成多核細(xì)胞，為動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)獲得者Cesar Milstein和Geoger Kohler（1975年）將免疫小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得了既能在體外無(wú)限繁殖，又能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，有力的促進(jìn)了免疫學(xué)的發(fā)展。
細(xì)胞工程技術(shù)發(fā)展迅速，試管植物、試管動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等相繼問(wèn)世。以色列用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)出人類(lèi)心臟組織，可以正常跳動(dòng)，以及美國(guó)培養(yǎng)的造血先驅(qū)細(xì)胞、中國(guó)培養(yǎng)的胃和腸粘膜組織等。1977年英國(guó)利用胚胎工程技術(shù)成功地培養(yǎng)出世界首例試管嬰兒，1997年英國(guó)首次克隆出綿羊“多莉”，2001年英國(guó)又培育出首批轉(zhuǎn)基因豬。
研究?jī)?nèi)容
根據(jù)研究對(duì)象的不同，可將細(xì)胞工程分為微生物細(xì)胞工程，植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程。
細(xì)胞工程的研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：
⑴動(dòng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)
主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。
⑵細(xì)胞融合
采用一定的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同的細(xì)胞（或原生質(zhì)體）融合為一個(gè)細(xì)胞，用于生產(chǎn)新的物種或品系及產(chǎn)生單克隆抗體。
⑶染色體工程
按人們的需要來(lái)添加、消減或替換染色體的一種技術(shù)。主要用于新品種的培育。
⑷胚胎工程
主要是對(duì)動(dòng)物的胚胎進(jìn)行某種人為的工程技術(shù)操作，獲得人們所需要的成體動(dòng)物，包括胚胎分割、胚胎融合、細(xì)胞核移植、體外受精、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、性別鑒定、胚胎冷凍技術(shù)等。
⑸細(xì)胞遺傳工程
主要包括動(dòng)物克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外援基因通過(guò)一定的方法和手段，整合到受體染色體上，得到穩(wěn)定、高效表達(dá)，并能遺傳給后代的試驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是改變生物遺傳性形狀的有效途徑，已在微生物、植物、動(dòng)物上得到應(yīng)用。
工程應(yīng)用
細(xì)胞工程在植物方面的應(yīng)用
⑴微繁殖技術(shù)（Micropropagation）的應(yīng)用
微繁殖技術(shù)，即以植物的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體為外植體，在離體培養(yǎng)條件下進(jìn)行植株再生的技術(shù)。應(yīng)用微繁殖技術(shù)既可用于克服高度雜合物種因有性繁殖而引起的后代嚴(yán)重分離，如澳大利亞的番木瓜；有可用于名優(yōu)或?yàn)l危物種的快速繁殖，如鳳梨、草莓。通過(guò)微繁技術(shù)已獲再生植株的樹(shù)種主要有番木瓜、柑橘、龍眼、荔枝、蘋(píng)果、梨、葡萄等，草莓、香蕉等以實(shí)現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。
通過(guò)莖尖培養(yǎng)或微嫁接技術(shù)，可以脫去植物體內(nèi)的病毒，獲得無(wú)病毒苗木，如蘋(píng)果、草莓等。另外，在組織培養(yǎng)過(guò)程中，如愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等，通過(guò)pH值、溫度、離子濃度等條件的變化，可增加其變異，從中可篩選出優(yōu)良的突變體，從而為新品種的選育開(kāi)辟一條嶄新的途徑。
愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等是基因轉(zhuǎn)化的良好受體材料，并且在離體培養(yǎng)條件下進(jìn)行植株再生也是實(shí)現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)。
此外，微繁技術(shù)為種質(zhì)的保存（germplasm storage）提供了新方法。很多種質(zhì)資源在離體培養(yǎng)條件下，通過(guò)減緩生長(zhǎng)和低溫處理而達(dá)到長(zhǎng)期保存目的，并可進(jìn)行不同國(guó)家、地區(qū)間的種質(zhì)資源收集、互換、保存和應(yīng)用，即建立“基因銀行”（gene bank），實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的全球共享。例如，在比利時(shí)Catholic University的Leuven研究中心有大量離體保存的香蕉種質(zhì)庫(kù)。
⑵細(xì)胞大量培養(yǎng)與有用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)
細(xì)胞大量培養(yǎng)有用次生代謝產(chǎn)物是植物細(xì)胞工程另一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域。通過(guò)細(xì)胞工程技術(shù)，刺激植物體內(nèi)某些重要次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，然后進(jìn)行分離、提純，如某些名貴藥物、香精、色素等，實(shí)現(xiàn)植物產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。
早在1964年我國(guó)就開(kāi)始進(jìn)行人參細(xì)胞培養(yǎng)。1980年以后，我國(guó)研究者相繼開(kāi)展了紫草、三七、紅豆杉、青蒿、紅景天和水母雪蓮等植物的細(xì)胞大量培養(yǎng)和研究，并利用生物反應(yīng)器進(jìn)行藥用植物的細(xì)胞大量培養(yǎng)的小試和中試。其中新疆紫草中試的規(guī)模達(dá)到100L，并小批量生產(chǎn)了紫草素，用于研制化妝品及抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物。紅豆杉細(xì)胞大量培養(yǎng)在我國(guó)也獲得初步成功，從細(xì)胞培養(yǎng)物中得到了珍貴的抗癌藥物紫杉醇，但產(chǎn)率還有待提高。
⑶單倍體（Haploid）技術(shù)的應(yīng)用
單倍體育種和相關(guān)研究在農(nóng)業(yè)和園藝植物中得到了廣泛的應(yīng)用。用Blakeslee等（1922年）和Kostoff（1941年）分別得到了單倍體植株單倍體有利于突變的檢測(cè)和抗性細(xì)胞系的篩選，并且大大縮短了育種的時(shí)間。此外單倍體在基因圖譜、基因轉(zhuǎn)移研究中具有重要作用。
自然形成的單倍體是極少見(jiàn)的，并且僅限于幾種植物。花藥培養(yǎng)是單倍體形成的重要途徑。自1964年第一例花藥培養(yǎng)獲得成功以來(lái)，花藥培養(yǎng)技術(shù)已取得了顯著的進(jìn)展，尤其在水稻、小麥、玉米等作物中已獲得巨大成功。現(xiàn)已取得成功的果樹(shù)樹(shù)種主要有番荔枝（Nair等，1983年）、番木瓜（Litz和Conover，1978年）、4個(gè)柑橘品種（Chen，1985年）、龍眼（Yang和Wei，1984年）、荔枝（Fu和Tang，1983年）、蘋(píng)果（Zhang等，1990年）、梨（Jordan，1975年）、葡萄（Rajasekaran和Mullins，1979年）等。薛光榮等（1980年）對(duì)東方草莓（四倍體）的單核期花粉進(jìn)行培養(yǎng)，成功的誘導(dǎo)出單倍體植株。
花藥培養(yǎng)主要是受基因型、花藥的發(fā)育階段、預(yù)處理和培養(yǎng)條件的影響，其存在的主要問(wèn)題是單倍體的誘導(dǎo)頻率低，單倍體自發(fā)加倍形成的二倍體與體細(xì)胞組織形成的二倍體很難區(qū)分。例如，F(xiàn)owler等（1971年）、Nishi等（1974年）和Rosati等（1975年）以八倍體草莓花藥為材料誘導(dǎo)愈傷組織，并分化出植株，發(fā)現(xiàn)其再生植株仍為八倍體，這些八倍體是由無(wú)性器官發(fā)育而來(lái)，還是由單倍體自發(fā)加倍而成則難以區(qū)分。
除花藥培養(yǎng)外，植物的卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反足細(xì)胞等單倍體細(xì)胞通過(guò)離體培養(yǎng)可以分化成單倍體胚或愈傷組織。胚珠、子房培養(yǎng)也曾進(jìn)行了大量嘗試，但大多數(shù)情況下，在愈傷組織階段生長(zhǎng)停止。
⑷胚培養(yǎng)（Embryo culture）
胚的離體培養(yǎng)是直接應(yīng)用于植物改良最早的組織培養(yǎng)技術(shù)。胚培養(yǎng)可以克服雜交后胚的衰亡，保證種內(nèi)或種間雜交的成功，或用于無(wú)性繁殖困難的植物的培養(yǎng)。胚培養(yǎng)還可以克服種子的休眠和敗育。Magdalita等（1996年）和Drew等（1997年）分別進(jìn)行了番木瓜的種內(nèi)雜交，得到合適的胚子后，進(jìn)行了胚培養(yǎng)，以促進(jìn)雜交成功。Jordan（1992年）得到了愈傷組織，但未得到再生植株。
澳大利亞國(guó)際農(nóng)業(yè)技術(shù)研究中心對(duì)番木瓜和其野生種的雜交胚進(jìn)行了培養(yǎng)研究，已獲成功，并得到了雜交后代，野生種的抗性、高含糖量等優(yōu)良性狀得到了遺傳。荔枝是較難進(jìn)行離體培養(yǎng)的果樹(shù)樹(shù)種之一，Kantharajah等（1992年）培養(yǎng)了長(zhǎng)度為3mm的荔枝幼胚。其他通過(guò)未成熟胚培養(yǎng)進(jìn)行再生的樹(shù)種有鱷梨、番荔枝和番木瓜等。姚強(qiáng)（1990年）對(duì)桃、油桃和番桃花后60d的未成熟胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了再生植株。J.Button等（1975年）利用甜橙種胚愈傷組織離體培養(yǎng)獲得了完整植株。
⑸原生質(zhì)體培養(yǎng)（Protoplast culture）與體細(xì)胞雜交（Somatic hybridization）
原生質(zhì)體是去掉細(xì)胞壁的單細(xì)胞，它是在離體培養(yǎng)條件下能夠再生完整植株的最小單位。每個(gè)原生質(zhì)體都含有該個(gè)體的全部遺傳信息，在適宜的培養(yǎng)條件下，具有再生成與其親本相似的個(gè)體的全能性。原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要目的是通過(guò)原生質(zhì)體的融合，克服遠(yuǎn)緣雜交障礙，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交，從而產(chǎn)生雜交后代。在原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中，往往產(chǎn)生大量的變異，可從中選擇優(yōu)良突變體。原生質(zhì)體可以攝取外源細(xì)胞器、病毒、DNA等各種大分子遺傳物質(zhì)，是進(jìn)行
細(xì)胞工程是生物工程的一個(gè)重要方面。總的來(lái)說(shuō)，它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，進(jìn)行在細(xì)胞水平上的遺傳操作及進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞和組織培養(yǎng)。當(dāng)前細(xì)胞工程所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體操作及基因轉(zhuǎn)移等方面。通過(guò)細(xì)胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價(jià)值的植株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。
細(xì)胞工程(Cell engineering)：
是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法，按照人們的需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上的遺傳操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過(guò)細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。
細(xì)胞工程與基因工程一起代表著生物技術(shù)最新的發(fā)展前沿，伴隨著試管植物、試管動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器等相繼問(wèn)世，細(xì)胞工程在生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
21世紀(jì)合成生物學(xué)的發(fā)展，采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、DNA或基因合成技術(shù)，人工設(shè)計(jì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，乃至整個(gè)基因組與細(xì)胞的人工設(shè)計(jì)與合成，從而刷新了基因工程與細(xì)胞工程技術(shù)，并將帶來(lái)生物計(jì)算機(jī)、細(xì)胞制藥廠(chǎng)、生物煉制石油等技術(shù)與產(chǎn)業(yè)革命。
