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微生物的分類,鑒定及命名
1,生物界的分類
地球上的物種估計大約有150萬,其中微生物超過10萬種,而且其數目還在不斷增加.
在生物進化歷史過程中演化形成生物種類和種群的多樣性.
生物分類就是通過研究生物的系統發育及其進化歷史,揭示各類生物的多樣性及其系統關系,編制分類系統,還原生物的自然歷史位置.
高等動植分類
化石資料,形態學,比較胚胎學
較正確反映其系統發育
微生物分類的難題:
絕大部分微生物個體小,形態簡單,易受環境影響而變異,缺少有性繁殖,缺乏化石資料.
生物分類的二種基本原則:
a)根據表型(phenetic)特征的相似程度分群歸類,這種
表型分類重在應用,不涉及生物進化或不以反映生
物親緣關系為目標;
b)按照生物系統發育相關性水平來分群歸類,其目標
是探尋各種生物之間的進化關系,建立反映生物系
統發育的分類系統.
★從兩界系統經歷過三界系統,四界系統,五界系統甚至六界系統,最后又有了三原界(或三總界)系統.
★傳統的,為多數學者所接受的是1969年魏塔克(R.H.Whittaker)在《Science》上提出的五界學說,它以縱向顯示從原核生物到真核單細胞生物再到真核多細胞生物的三大進化過程.
生物的界級分類學說
利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家
Carl Woese
三域學說的建立
(1)古細菌原界(Archaebacteria) ,包括產甲烷細菌,極端嗜鹽菌和嗜熱嗜酸菌;
(2)真細菌原界(Eubacteria) ,包括藍細菌和各種除古細菌以外的其它原核生物;
(3)真核生物原界(Eucaryotes),包括原生生物,真菌,動物和植物.
2,微生物分類學
經典分類學:按微生物表型分類
微生物系統學:按親緣關系和進化規律分類
發展
表型特征:形態學,生理生化學,生態學等,推斷微生物的系統發育.
表型特征結合分子水平上比較微生物的基因型特征(如16S rRNA)探討微生物進化,系統發育和分類鑒定.
★微生物分類學的三個任務:分類,鑒定及命名
☆分類是根據微生物的相似性和親緣關系,將微生物歸入不同的分類類群.
☆鑒定是確定一個新的分離物屬于已經確認的分類單元的過程.
☆命名是根據國際命名法規給微生物分類單元以科學的名稱.
以啤酒酵母為例,它在分類學上的地位是:
界(Kindom):真菌界
門(Phyllum):真菌門
綱(Class):子囊菌綱
目(Order):內孢霉目
科(Family):內孢霉科
屬(Genus):酵母屬
種(Species):啤酒酵母
3,微生物的分類單位
界,門,綱,目,科,屬,種
種是最基本的分類單位
每一分類單位之后可有亞門,亞綱,亞目,亞科...
種(species):是一個基本分類單位;是一大群表型特征高度相似,親緣關系極其接近,與同屬內其他種有明顯差別的菌株的總稱.
菌株(strain): 表示任何由一個獨立分離的單細胞繁殖而成的純種群體及其一切后代(起源于共同祖先并保持祖先特性的一組純種后代菌群).因此,一種微生物的不同來源的純培養物均可稱為該菌種的一個菌株.菌株強調的是遺傳型純的譜系.
例如:大腸埃希氏桿菌的兩個菌株:
Escherichia coli B 和Escherichia coli K12
★菌株的表示法:
★種是分類學上的基本單位,菌株是實際上應用的基本單位,因為同一菌種的不同菌株在產酶上種類或代謝物產量上會有很大的不同和差別!
亞種(subspecies)或變種(variety):
為種內的再分類.
當某一個種內的不同菌株存在少數明顯而穩定的變異特征或遺傳形狀,而又不足以區分成新種時,可以將這些菌株細分成兩個或更多的小的分類單元——亞種.
變種是亞種的同義詞,因"變種"一詞易引起詞義上的混淆,從1976年后,不在使用變種一詞.通常把實驗室中所獲得的變異型菌株,稱之為亞種.
如:E.coli k12(野生型)是不需要特殊aa的,而實驗室變異后,可從k12獲得某aa的缺陷型,此即稱為E.coli k12的亞種.
型(form):
常指亞種以下的細分.當同種或同亞種內不同菌株之間的性狀差異不足以分為新的亞種時,可以細分為不同的型.
例如:按抗原特征的差異分為不同的血清型;
學名—是微生物的科學名稱,它是按照有關微生物分類國際委員會擬定的法則命名的.學名由拉丁詞,或拉丁化的外來詞組成.學名的命名有雙名法和三名法兩種.
①雙名法:
學名=屬名+種名+(首次定名人)+現定名人+定名年份
屬名:拉丁文的名詞或用作名詞的形容詞,單數,首字母大寫,表示微生物的主要特征,由微生物構造,形狀或由科學家命名.
種名:拉丁文形容詞,字首小寫,為微生物次要特征,
如微生物色素,形狀,來源或科學家姓名等.
4,微生物的命名
必要,用斜體表示
可省略,用正體字
微生物的名字有俗名和學名兩種.如: 紅色面包霉———粗糙脈孢霉
綠膿桿菌———銅綠假單胞菌
例:大腸埃希氏桿菌
Escherichia coli (Migula)Castellani et Chalmers 1919
金黃色葡萄球菌
Staphylococcus aureus Rosenbach 1884
◆當泛指某一屬微生物,而不特指該屬中某一種(或未定種名)時,可在屬名后加sp.或ssp.(分別代表species 縮寫的單數和復數形式)
例如:Saccharomyces sp.
表示酵母菌屬中的一個種.
◆菌株名稱——在種名后面自行加上數字,地名或符號等,如: Bacillus subtilis AS1.389 AS=Academia Sinica
Bacillus subtilis BF7658 BF=北紡
Clostridium acetobutylicum ATCC824 丙酮丁醇梭菌
ATCC=American Type Culture Collection美國模式菌種保藏中心
◆當文章中前面已出現過某學名時,后面的可將其屬名縮寫成1~3個字母.
如:Escherichia coli 可縮寫成 E.coli
Staphylococcus aureus可縮寫成 S. aureus
②三名法:用于對亞種的命名,這時在屬和種名后加寫一個subsp.,然后再附上亞種名稱(斜排體). 如:
Bacillus thuringiensis subsp. galleria
蘇云金芽孢桿菌臘螟亞種
形態結構,生理生化,少量的化石資料,行為習性,等等
表型特征:
5, 進化指征的選擇:
b)形態特征在不同類群中進化速度差異很大,僅根據形態推斷進化關系往往不準確;
缺點:
a)由于微生物可利用的形態特征少,很難把所有生物放在同一水平上進行比較;
蛋白質,RNA和DNA序列進化變化的顯著特點是進化速率相對恒定,也就是說,分子序列進化的改變量(氨基酸或核苷酸替換數或替換百分率)與分子進化的時間成正比.
生物大分子作為進化標尺依據
a)在兩群生物中,如果同一種分子的序列差異很大時,
------------進化距離遠,進化過程中很早就分支了.
b)如果兩群生物同一來源的大分子的序列基本相同,
------------處在同一進化水平上.
大量的資料表明:功能重要的大分子,或者大分子中功能重要
的區域,比功能不重要的分子或分子區域進化變化速度低.
RNA作為進化的指征
16S rRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的"分子尺":
1)rRNA具有重要且恒定的生理功能;
2)在16SrRNA分子中,既含有高度保守的序列區域,又有中度保守和高度變化的序列區域,因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關系的研究;
3)16SrRNA分子量大小適中,便于序列分析;
4)rRNA在細胞中含量大(約占細胞中RNA的90%),也易于提取;
5)16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同
源分子是18SrRNA).因此它可以作為測量各類生物進化的工具.
Eubacteria
(真細菌界)
Archaebacteria
(古細菌界)
Eukarya
(真核生物界)
Carl Woese利用16SrRNA建立分子進化樹
微生物
(病毒)
古生菌(Archaea)
細菌(Bacteria)
真菌(酵母,霉菌,蕈菌等),
單細胞藻類,原生動物等
非細胞型
細胞型
原核微生物
真核微生物(Eukarya)
古生菌在進化譜系上與真細菌及真核生物相互并列,且與后者關系
更近,而其細胞構造卻與真細菌較為接近,同屬于原核生物.
6,微生物分類鑒定的特征和技術
形態學特征,
生理學特征,
生態學特征
6.1 生物分類的傳統指標:
☆形態學特征
培養特征,
運動性,
特殊的細胞結構,
細胞形態及其染色特性,
等等
微生物分類和鑒定的重要依據之一:
a)易于觀察和比較,尤其是真核微生物和具有特殊
形態結構的細菌;
b)許多形態學特征依賴于多基因的表達,具有相對
的穩定性;
☆生理生化特征?
與微生物的酶和調節蛋白質的本質和活性直接相關;
代謝產物等
營養類型;
與氧的關系;
對溫度的適應性;
對pH的適應性;
對滲透壓的適應性;
酶及蛋白質都是基因產物;
對微生物生理生化特征的比較也是對微生物基因組的間接比較;
測定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多;
常借助特異性的血清學反應來確定未知菌種,亞種或菌株.
★生態特性
包括在自然界的分布情況,與其他生物有否寄生或共生關系, 宿主種類及與宿主關系, 有性生殖情況, 生活史等.
★血清學反應
6.2 核酸的堿基組成和分子雜交
特點:
與形態及生理生化特性的比較不同,對DNA的堿基
組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微
生物之間基因組的差異,因此結果更加可信.
(1) DNA的堿基組成(G+Cmol%)
DNA堿基因組成是各種生物一個穩定的特征,即使個別基因突變,堿基組成也不會發生明顯變化.
分類學上,用G+C占全部堿基的克分子百分數(G+Cmol%)來表示各類生物的DNA堿基因組成特征.
◆每個生物種都有特定的GC%范圍,因此后者可以作為分類鑒定的指標.細菌的GC%范圍為25--75%,變化范圍最大,因此更適合于細菌的分類鑒定.
◆GC%測定主要用于對表型特征難區分的細菌作出鑒定,并可檢驗表型特征分類的合理性,從分子水平上判斷物種的親緣關系.
使用原則:
G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定
每一種生物都有一定的堿基組成,親緣關系近的生物,
它們應該具有相似的G+C含量,若不同生物之間G+C含
量差別大表明它們關系遠.
但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關系.
同一個種內的不同菌株G+C含量差別應在4～5%以下;同屬不同種的差別應低于10～15%;G+C含量已經作為建立新的微生物分類單元的一項基本特征,它對于種,屬甚至科的分類鑒定有重要意義.
若二個在形態及生理生化特性方面及其相似的菌株,如果其G+C含量的差別大于5%,則肯定不是同一個種,大于15%則肯定不是同一個屬.
在疑難菌株鑒定,新種命名,建立一個新的分類單位時,G+C含量是一項重要的,必不可少的鑒定指標.
其分類學意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元.
G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定
(2) 核酸的分子雜交
不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關系的遠近,堿基排列順序差異越小,它們之間的親緣關系就越近,反之亦然.
核酸分子雜交(hybridization)間接比較不同微生物DNA堿基排列順序的相似性
a)DNA-DNA雜交;
(親緣關系相對近的微生物之間的親緣關系比較)
b)DNA-rRNA雜交;
(親緣關系相對遠的微生物之間的親緣關系比較)
c)核酸探針;
(利用特異性的探針,用于細菌等的快速鑒定)
(3) 16SrRNA或18SrRNA的核酸序列分析
16SrRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的"分子尺":
16SrRNA的序列高度保守,可精確指示細菌之間的親緣關系
16SrRNA的大小為1500bp左右,所含信息能反映生物界進化關系,易操作,適用于各級分類單元
目前常用的是建立在PCR技術基礎上的16SrRNA基因的直接測序法,方便快捷.
《伯杰氏鑒定細菌學手冊》
(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)
美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)
1957年第七版后,由于越來越廣泛地吸收了國際上細菌分類學家參加編寫(如1974年第八版,撰稿人多達130多位,涉及15個國家;現行版本撰稿人多達300多人,涉及近20個國家),所以它的近代版本反映了出版年代細菌分類學的最新成果,因而逐漸確立了在國際上對細菌進行全面分類的權威地位.
7.1 細菌分類系統
7,微生物分類系統
《伯杰氏系統細菌學手冊》
(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)
伯杰氏手冊是目前進行細菌分類,鑒定的最重要依據,其特點是描述非常詳細,包括對細菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法.
(20世紀80年代末期)
7.2 真菌分類系統
真菌界分類系統很多,各國采用不同的系統,比較混亂.近年來為較多人接受的是Ainsworth的綱要.
俗名—common name簡潔易懂,方便記憶,但涵義往往不夠準確,還有適用范圍和地區性的限制.
命名—scientific name菌種的科學名稱.菌種的學名是按照《國際細菌命名法規》命名的國際學術界公認,并通用的名稱.
命名原則:
學名=屬名+種的加詞+(首次定名人)+現名定名人和鮮明定名年份
規定與常識:屬名應大寫首字母,單數,可以組合外而成.種的加詞代表一個種的次要特征,首字小寫
自動微生物鑒定系統是傳統的微生物鑒定主要參考《伯杰式細菌鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》，鑒定過程繁瑣，耗時長，容易出錯，對經驗要求非常高。
商品化的自動微生物系統有效地解決了這個問題，目前自動微生物鑒定系統從原理上包括以下幾種：
1)基于表型的鑒定方法：如美國Biolog公司的Microstation和Omnilog自動微生物鑒定系統，基于95種碳源或化學敏感物質的利用為原理，可鑒定細菌、酵母和霉菌超過2650種；另外還有基于脂肪酸鑒定的方法，采用氣相色譜分析微生物細胞壁的脂肪酸構成；在臨床領域，梅里埃、BD、熱電和西門子都有相應的自動微生物鑒定系統，其數據庫主要以鑒定致病菌為主，通常是200-600種數據庫，可做藥敏測試；
2)基于基因型的鑒定方法：如基因測序法及基因條帶圖譜法，以Life和杜邦為典型代表。
3)基于蛋白的鑒定方法：以布魯克和梅里埃為代表，基于蛋白質飛行質譜平臺，分析不同高度保守的微生物核糖體蛋白電解離后的電子飛行時間進行鑒定。
三類方法各有優缺點，理論上不沖突，應該互為補充，應根據需要進行選擇。
微生物質譜儀檢測原理如下：
微生物的質譜鑒定是一種基于細菌全細胞蛋白質組指紋圖譜分析的技術，與Sherlock全自動微生物鑒定系統的細胞脂肪酸成分分析相類似，質譜分析亦需要通過專門的數據分析和專家系統對未知細菌的特殊蛋白圖譜與菌種文庫中收集的菌種蛋白質組指紋圖譜進行比較。
由于微生物質譜分析的蛋白質大分子適合于飛行時間質量分析器（time-of-flight analyzer），因此，微生物的質譜鑒定被統稱為基質輔助激光解吸電離的飛行時間質譜技術（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）。
MALDI-TOF MS能直接對微生物的蛋白質混合物進行分析，具有適應范圍廣、準確、靈敏、特異、鑒定快速、高通量。
質譜分析本是一種物理方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發生電離，生成不同荷質比的帶正電荷的離子，經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中，再利用電場和磁場使發生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。
以上就是微生物分析系統的全部內容，Milliflex-plus微生物限度檢驗系統是一種簡單而快速的對液體樣品進行微生物檢驗的方法。膜過濾法（MF）一直以來被認為是最為可靠的微生物檢驗方法,但由于因為耗時的儀器及過濾器的準備與操作未被廣泛的應用于微生物檢測中。
